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　　人核因子κB受體活化因子配基(RANKL)ELISA試劑盒實驗使用說明書 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀守法，嚴于律己，寬仁以待，敢于承擔的企業(yè)精神作為標準，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標，本生，您信任的合作伙伴！本生試劑盒

　　檢測原理

　　試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被核因子κB受體活化因子配基(RANKL)抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的核因子κB受體活化因子配基(RANKL)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值)，計算樣品濃度。

　　樣品收集、處理及保存方法

　　1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

　　2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

　　3. 細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

　　4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

　　5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

　　自備物品

　　酶標儀(450nm)

　　高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

　　37℃恒溫箱

　　操作注意事項

　　試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶溶解后再使用。

　　實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封(低溫干燥)保存。

　　濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白;按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍，最終結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。

　　嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

　　所有液體組分使用前充分搖勻。

　　試劑盒組成名稱96孔配置48孔配置備注

　　微孔酶標板12孔×8條12孔×4條無

　　標準品0.3mL*6管0.3mL*6管無

　　樣本稀釋液6mL3mL無

　　檢測抗體-HRP10mL5mL無

　　20×洗滌緩沖液25mL15mL按說明書進行稀釋

　　底物A6mL3mL無

　　底物B6mL3mL無

　　終止液6mL3mL無

　　封板膜2張2張無

　　說明書1份1份無

　　自封袋1個1個無

　　注：標準品(S0-S5)濃度依次為：0、50、100、200、400、800 pg/mL

　　試劑的準備

　　20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

　　洗板方法

　　手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

　　自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

　　操作步驟

　　從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

　　設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;

　　樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL;空白孔不加。

　　除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

　　棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。

　　每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

　　每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

　　結(jié)果判斷

　　繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

　　試劑盒性能

　　準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

　　靈敏度：檢測濃度小于1.0 pg/mL。

　　特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應。

　　重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

　　貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

　　有效期：6個月