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　　本生闡述：小鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 ELISA試劑盒技術(shù)資料

　　適用于小鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本

　　介紹：

　　轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的 TGF-β超家族。這一家族除 TGF-β1 至TGF-β5 外，還有活化素、抑制素、繆勒氏管抑制物質(zhì)(MIS)和骨形成蛋白(BMPs)(1)。TGF-β是根據(jù)這種細(xì)胞因子能使正常的成纖維細(xì)胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化命名的。TGF-β1 的生物學(xué)功能主要在炎癥、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等方面，TGF-β對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用。

　　檢測(cè)原理：

　　ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。將

　　抗小鼠 TGF-β1 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上;分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 TGF-β1 會(huì)與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合;洗板后加入生物素化抗小鼠 TGF-β1 抗體，該抗體會(huì)與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 TGF-β1發(fā)生特異性結(jié)合;洗板后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會(huì)發(fā)生高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合;洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的小鼠 TGF-β1，則 HRP 會(huì)使無色 TMB 變成不同深淺(正相關(guān))的藍(lán)色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會(huì)變成黃色;最后，在λmax=450 nm(OD=450 nm)處測(cè)定反應(yīng)孔樣品吸光度(OD)，樣本中的小鼠 TGF-β1 濃度與 OD 成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計(jì)算出樣本中小鼠 TGF-β1 的濃度。

　　注意事項(xiàng)：

　　1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請(qǐng)不要使用過期的試劑。

　　2. 試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請(qǐng)丟棄。

　　3. 試劑盒使用前請(qǐng)?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。

　　4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測(cè)，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。

　　5. 為避免交叉污染，請(qǐng)?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜(※)及潔凈塑料容器。

　　6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運(yùn)輸過程中微量液體會(huì)沾到管壁及瓶蓋上，使用前請(qǐng)離心處理(5-10 S 即可)，使管壁上的液體集中在管底部，取用時(shí)，請(qǐng)用移液器小心吹打幾次。

　　7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請(qǐng)不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。

　　8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測(cè)均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　安全提示：

　　試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時(shí)請(qǐng)帶上手套并注意防護(hù);在操

　　作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請(qǐng)用大量清水清洗;檢測(cè)血液樣本及其它體液樣本時(shí)，請(qǐng)按國(guó)家生物實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

　　試劑盒組成及儲(chǔ)存：

　　1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 ;

　　2 酶標(biāo)試劑 6ml×1 瓶

　　3 酶標(biāo)包被板 12 孔×8 條 ;

　　4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶

　　5 顯色劑A 液 6ml×1 瓶 ;

　　6 顯色劑B 液 6ml×1/瓶

　　7 終止液 6ml×1 瓶;

　　8 標(biāo)準(zhǔn)品(48ng/ml) 0.5ml×1 瓶

　　9 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1 瓶;

　　10 說明書 1 份

　　11 封板膜 2 張; 12 密封袋 1 個(gè)

　　自備實(shí)驗(yàn)器材(不提供，可代購(gòu))

　　1. 酶標(biāo)儀(主波長(zhǎng) 450nm，參考波長(zhǎng) 630nm)

　　2. 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

　　3. 洗板機(jī)或洗瓶

　　4. 37℃孵育箱

　　5. 雙蒸水，去離子水，量筒等

　　6. 稀釋用聚丙烯試管

　　樣本收集及儲(chǔ)存：

　　1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：

　　將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存(24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存)，避免反復(fù)凍融。

　　2. 血清樣本：

　　室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存(24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存)，保存過程中如有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心，避免反復(fù)凍融。

　　3. 血漿樣本：

　　將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小EP 管并于-20℃下保存(24 小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入 2-8℃儲(chǔ)存)，避免反復(fù)凍融。

　　注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測(cè)結(jié)果;如果樣本中的靶標(biāo)物檢測(cè)濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的高值，請(qǐng)將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測(cè)，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。

　　試劑準(zhǔn)備：

　　1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測(cè)樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請(qǐng)放入 37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。

　　2. 配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

　　3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液(SR1)1ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后按照以下濃度：1000、 500、 250、125、62.5、31.25、 15.62 pg/ml進(jìn)行2倍梯度稀釋。1000pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)，0pg/ml(即只添加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液(SR1))為標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液(2000pg/ml)未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液(1000pg/ml)未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

　　4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量，用檢測(cè)稀釋液(SR2)將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液(稀釋前充分混勻)，請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

　　5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液(SR3)將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液(稀釋前離心)，請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。

　　6. 標(biāo)本預(yù)處理:

　　血清或血漿標(biāo)本激活方法:

　　1). 在225μl標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液(1b)中，加入5μl血清或血漿標(biāo)本。

　　2). 加10μl 1 N HCl，蓋緊，上下混勻。2-8℃放置60±2分鐘。

　　3). 加10μl 1 N NaOH，蓋緊，上下混勻。(總體積250μl即50倍稀釋)

　　4). 即用，或置-20/-70℃可保存3天。計(jì)算結(jié)果時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

　　(注意：不同的標(biāo)本TGF-β1的水平可能有較大差異，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況靈活掌握稀釋度)

　　細(xì)胞培養(yǎng)上清標(biāo)本激活方法:

　　1). 在80μl標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液(1b)中，加入100μl標(biāo)本。

　　2). 加10μl 1N HCl，蓋緊，上下混勻。2-8℃放置60±2分鐘. 3). 加10μl 1N NaOH，蓋緊，上下混勻。(總體積200μl即2倍稀釋)。

　　4). 即用，或置-20/-70℃可保存3天。計(jì)算結(jié)果時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。. (注意：不同的標(biāo)本TGF-β1的水平可能有較大差異，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況靈活掌握稀釋度)

　　7. 洗滌方法：

　　自動(dòng)洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/

　　孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。

　　手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液

　　300ul/孔，靜止 30 秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。

　　結(jié)果判斷：

　　1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定 OD 值。選擇雙波長(zhǎng)檢測(cè)，參考波長(zhǎng)為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)，請(qǐng)用 450 nm 的 OD 測(cè)定值減去 630 nm 的 OD 測(cè)定值。

　　2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值。

　　3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中TGF-β1含量可通過對(duì)應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

　　4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。

　　2. 靈敏度：

　　可檢測(cè)小鼠 TGF-β1 濃度達(dá) 8pg/ml，

　　20 個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算相應(yīng)的可檢測(cè)濃度。

　　3. 特異性：

　　不與小鼠 TGF-β RI/Fc Chimera 反應(yīng)，人的 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 等反應(yīng)

　　4. 重復(fù)性：

　　板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%

　　5. 回收率：

　　在選取的健康小鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個(gè)不同濃度水平的小鼠 TGF-β1，計(jì)算回收率。

　　6. 線性稀釋：

　　分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 TGF-β1，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評(píng)估線性。

　　小鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 ELISA試劑盒 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場(chǎng)，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠(chéng)合作，共創(chuàng)美好的未來。