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　　本生帶您了解、小分子化合物(熒光染料)

　　熒光染料是指吸收某一波長的光波后能發(fā)射出另一波長大于吸收光的光波的物質(zhì)。由于靈敏度高，操作方便，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標記，其廣泛應用于熒光免疫，細胞染色等。熒光染料即可以單獨使用，也可以組合成復合熒光染料使用，用于染色體分析、細胞周期、細胞凋亡等相關研究。另有很多核酸染料在多色染色系統(tǒng)中是非常有用的復染劑，可作為背景對照，標記細胞核使細胞內(nèi)結構的空間關系一目了然。

　　常用核酸染料

　　DAPI是結合富含A-T堿基對DNA序列的熒光染料。DAPI是一種能夠與DNA中大部分A，T堿基相互結合的熒光染料﹐常用于熒光顯微鏡觀測。因為DAPI可以透過完整的細胞膜﹐它可以用于活細胞和固定細胞的染色。當DAPI與雙鏈DNA結合時，最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nm。DAPI的發(fā)射光為藍色，且DAPI和綠色熒光蛋白GFP或Texas Red染劑(紅色熒光染劑)的發(fā)射波長僅有少部分重疊，可以利用這項特性在單一的樣品上進行多重熒光染色。

　　一般的，用于細胞核染色時，推薦的DAPI工作濃度為0.5-10μg/mL。

　　Hoechst 33342是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，它在嵌入雙鏈 DNA后釋放強烈的藍色熒光，對細胞的毒性較低。Hoechst 33342染色常用于細胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。Hoechst 33342也常用于普通的細胞核染色，或常規(guī)的DNA染色。Hoechst 33342的最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm;Hoechst 33342和雙鏈DNA結合后，最大激發(fā)波長為350nm，最大發(fā)射波長為461nm。

　　細胞凋亡檢測

　　JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時;JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降,同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。

　　活性氧檢測

　　DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內(nèi)活性氧的水平。

　　ROS熒光探針-DHE

　　DHE是一種可滲透細胞的藍色熒光探針，是過氧化物指示劑，可用于檢測細胞內(nèi)superoxide radical anion，能有效地檢測活性氧類。這種染料可以自由地進入細胞中，脫氫后成為Ethidium。DHE可以直接用于活細胞的標記。DHE被活細胞攝入后，可以在細胞內(nèi)的超氧化物陰離子作用下脫氫，產(chǎn)生Ethidium。Ethidium可以和RNA或DNA結合產(chǎn)生紅色熒光。當細胞內(nèi)的超氧化物陰離子水平較高時，產(chǎn)生的Ethidium較多，紅色熒光就較強，反之則較弱。DHE本身為藍色熒光，最大激發(fā)波長為370nm，最大發(fā)射波長為420nm，脫氫后和RNA或DNA結合產(chǎn)生紅色熒光，最大激發(fā)波長為300nm，最大發(fā)射波長為610nm，實際觀察時也可以使用535nm作為激發(fā)波長。

　　一般的，用于細胞內(nèi)超氧化物陰離子檢測時，DHE的常用濃度為1-10μM。

　　鈣離子濃度檢測

　　Fluo-3 AM是常用的檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針之一。它穿透細胞膜進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成 Fluo-3，從而被滯留在細胞內(nèi)，F(xiàn)luo-3若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光性的，但是當它與細胞內(nèi)鈣離子結合后可以產(chǎn)生較強的熒光，最大激發(fā)波長為506nm，最大發(fā)射波長為526nm。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右，發(fā)射波長為525-530nm?？梢允褂眉す夤簿劢癸@微鏡或流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

　　其他染料

　　尼羅紅是一種親脂性的惡嗪類熒光染料，與脂類物質(zhì)結合并發(fā)出熒光，在激發(fā)波長530nm激發(fā)下，顯示強烈桔紅色熒光。常用于檢測細胞內(nèi)脂滴。

　　Calcein-AM是一種可對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，它穿透細胞膜進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Calcein，從而被滯留在細胞內(nèi)，發(fā)出強綠色熒光。Calcein的激發(fā)和發(fā)射波長分別為490nm和515nm。Calcein-AM和PI經(jīng)常被結合用來作為活細胞和死細胞的雙重染色。

　　FITC是在熒光素的基礎上通過化學反應增加(異)硫氰酸基團得到的，硫氰酸基團可以和生物活性物質(zhì)例如蛋白質(zhì)上的伯胺基團反應形成硫脲鍵，從而實現(xiàn)對生物活性物質(zhì)的熒光標記。FITC能和各種抗體蛋白等物質(zhì)結合，通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞儀分析可進行定性、定位或定量的檢測。

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