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　　實驗干貨—ELISA實驗過程中的常見問題解答
 

　　ELISA實驗中會遇到很多問題，不是這有點小問題，就是那有點小問題，那該怎么辦呢?以下便是天津本生技術小編是我們在多年的實驗過程中遇到問題的總結：

　　Q1.標曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色

　　溶解標準品以及倍比稀釋時，未渦旋震蕩或不夠充分。標準品溶解、倍比稀釋時均需要渦旋震蕩以充分混勻。單純依靠移液器反復吹打，效率較低、效果也不一定。

　　Q2.標曲和樣本均不顯色

　　在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導致顯色偏弱，推薦孵育階段，使用ELISA用的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，結合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。

　　Q3.標曲顯色，樣本不顯色

　　當樣本中目的蛋白濃度低或者樣本中干擾因素較強，就無法檢測到。目ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度的方法，與不同技術結合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測靈敏度。

　　對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度，只能說可以提高樣本的可測率，并使結果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信。

　　Q4.標曲和樣本都顯色，但復孔的CV大

　　這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關了。移液器的使用維護不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大;實驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。

　　掌握移液器的正確使用和維護。關于個人的操作可練習移液動作、加快速度，確保移液的精密度。

　　Q5.本底偏高，樣本值測不到

　　標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號，導致無法測到樣本值。

　　在加入TMB顯色后，需實時觀察標曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色，即可終止反應。

　　Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋，計算得到的樣本值差異較大

　　有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應該如何稀釋，那么我們就會做下預實驗，確定稀釋倍數(shù)。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，計算得到的樣本值之間差異較大，應該選擇哪一個稀釋倍數(shù)呢?

　　這里涉及到了基質效應。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質效應較明顯。而經(jīng)過稀釋后，干擾因素也隨之稀釋，影響就會較小。當某兩個梯度稀釋后，計算得到的樣本值接近時，我們就可以認為在該稀釋梯度時，樣本中的干擾因素影響較小，計算得到的值也是接近真實的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本，經(jīng)過多倍稀釋后，就更加測不到了，此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。

　　Q7.不同試劑盒中的組分能否通用

　　除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標準品、標準品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的，如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分，有可能對結果產(chǎn)生影響。

　　ELISA試劑盒本生公司產(chǎn)品種類已超過萬種，正廣泛應用于科研院校、中心實驗室、分子生物學等科研域。公司豐富的產(chǎn)品既能滿足研發(fā)類客戶對產(chǎn)品種類、包裝的特殊要求，也能滿足生產(chǎn)型企業(yè)從小試、中試到規(guī)模化生產(chǎn)各個階段的綜合需求。